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pKD3 pKD46 pCP20大肠杆菌基因敲除实验步骤-----供参考

2026-05-05

一、菌株与质粒准备
实验菌株：大肠杆菌（如MG1655、BW25113等）
辅助质粒：- pKD46 ：表达λ Red重组酶（Exo、Bet、Gam），温度敏感型复制子，氨苄抗性
pKD3 ：氯霉素抗性模板质粒，需在pir⁺菌株中保藏
pCP20 ：表达FLP重组酶，温度敏感型复制子，氨苄/氯霉素双抗性
试剂：- 抗生素：氨苄青霉素（Amp, 100 mg/mL）、氯霉素（Cm, 25 mg/mL）
10% L-阿拉伯糖（诱导Red重组酶表达）
无抗LB液体/固体培养基、含相应抗生素的LB培养基
高保真DNA聚合酶、PCR引物、DpnI限制性内切酶
感受态制备试剂（10%甘油、预冷的超纯水）
2. 引物设计
需要设计一对敲除引物，结构如下：
上游引物（5'→3'）：
[靶基因同源臂（36-50 bp）] + CAGTCGTAGGCTGATCAGCGG
下游引物（5'→3'）：
[靶基因反向互补同源臂（36-50 bp）] + AGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC
原理：3'端序列用于扩增pKD3上的 FRT-Cm-FRT 片段，5'端的同源臂用于后续和大肠杆菌基因组发生同源重组。
二、：以pKD3为模板，PCR扩增抗性片段

PCR反应体系（50μL）组分	体积
10×高保真缓冲液	5 μL
dNTPs（2.5 mM each）	4 μL
上游引物（10 μM）	2 μL
下游引物（10 μM）	2 μL
pKD3质粒模板（10-50 ng/μL）	1 μL
高保真DNA聚合酶	0.5 μL
ddH₂O	50 μL

PCR程序plaintext
95℃ 预变性 3 min
95℃ 变性 30 s
55-60℃ 退火 30 s （根据引物Tm调整）
72℃ 延伸 1 min/kb （pKD3上的Cm片段约1.1 kb，延伸1.5 min即可）
重复30个循环
72℃ 终延伸 5 min
3. PCR产物处理- 用DpnI酶切PCR产物 1 h（37℃），消化模板质粒pKD3，避免后续实验中质粒污染
-用PCR纯化试剂盒回收片段，洗脱至30 μL ddH₂O中，-20℃保存备用
三、Step 2：制备表达pKD46的大肠杆菌感受态
1. 将pKD46转化至你的目标大肠杆菌菌株，涂布于含Amp（100 μg/mL）的LB平板，30℃培养过夜（pKD46的复制子在37℃不稳定，必须30℃培养）
2. 挑取单菌落接种于5 mL LB（含Amp 100 μg/mL），30℃、220 rpm摇至OD₆₀₀≈0.4-0.6
3. 加入L-阿拉伯糖（终浓度10 mM），继续30℃摇1 h，诱导Red重组酶表达
4. 冰上预冷30 min，4℃ 4000 g离心10 min收集菌体
5. 用预冷的10%甘油洗涤菌体3次，最后重悬于100 μL 10%甘油中，即为感受态细胞，现制现用
四、Step 3：电转抗性片段，筛选重组菌株
1. 取50 μL感受态细胞，加入10-20 μL纯化后的PCR片段，轻轻混匀
2. 转移至预冷的电转杯（0.2 cm），电转参数：2.5 kV、25 μF、200 Ω
3. 立即加入1 mL无抗LB，37℃、220 rpm复苏培养1 h
4. 取100-200 μL菌液涂布于含Cm（25 μg/mL）的LB平板，37℃培养过夜
5. 挑取单菌落，用PCR验证抗性片段是否正确替换了靶基因（用基因组外侧的验证引物扩增）
五、Step 4：去除FRT位点间的氯霉素抗性标记（无痕化）
1. 将验证正确的重组菌株接种于无抗LB，37℃培养至OD₆₀₀≈0.4，制备感受态细胞
2. 转化pCP20质粒，涂布于含Amp（100 μg/mL）的LB平板，30℃培养过夜（pCP20为温度敏感型，需30℃培养）
3. 挑取单菌落接种于无抗LB，42℃摇菌过夜（高温诱导FLP重组酶表达，同时消除pCP20质粒）
4. 划线分离单菌落，分别点在无抗LB、含Cm的LB、含Amp的LB平板上- 正确的菌株：在无抗LB上生长，在Cm和Amp平板上不生长
5. 用基因组外侧引物PCR验证抗性标记已被切除，仅保留单个FRT位点
六、关键注意事项&避坑指南
1. pKD46和pCP20的温度控制：- 保藏/扩增必须在30℃进行，37℃会丢失质粒
- 诱导重组酶或消除质粒时，需按实验步骤切换温度
2. DpnI处理的必要性：pKD3质粒模板必须被DpnI完全消化，否则会出现假阳性抗性菌落
3. Red重组效率：- 电转时的感受态细胞必须新鲜制备，且OD值严格控制在0.4-0.6
- 阿拉伯糖诱导时间不宜过长，避免菌体死亡
4. 抗性标记残留验证：- 抗性切除后，必须同时做Cm和Amp的抗性平板验证，确保无质粒残留
- PCR产物建议测序确认，避免发生非特异性重组

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