使用pCRISPR 和 pCas9质粒敲除实验-仅供参考

使用pCRISPR 42875 和pCas9  42876敲除实验----仅供参考

通过Cas9切割+同源重组实现大肠杆菌基因敲除，核心流程为sgRNA构建→共转化→诱导重组→筛选鉴定→质粒消除  。

一、实验核心信息

-适配菌株：常规克隆菌株（DH5α、TOP10）；若需高效同源重组，优先用HME63（含λ Red系统）或MG1655  。

二、实验步骤

（1） 靶点设计与sgRNA寡核苷酸合成

1. 选择靶基因ORF内20 bp序列，3'端紧邻NGG PAM序列（如5'-N20-NGG-3'） 。

2. 工具推荐：CHOPCHOP、CRISPR Design Tool，优先选脱靶评分低的靶点。

3. 寡核苷酸设计（适配pCRISPR BsaI位点） ：

- 正向寡核苷酸：5'-AAAC + N20序列（5'端加AAAC，与BsaI酶切粘性末端匹配）

- 反向寡核苷酸：5'-AAAA + 反向互补N20序列（5'端加AAAA，与BsaI酶切粘性末端匹配）

- 示例：靶点5'-ATCGATGCTAGCTAGCTAG-3'（PAM为NGG），则正向为5'-AAACATCGATGCTAGCTAGCTAG-3'，反向为5'-AAAA CTAGCTAGCTAGCATCGAT-3'。

（2）. pCRISPR-sgRNA载体构建（BsaI酶切-连接）

1. 质粒提取：提取pCRISPR（42875）高纯度质粒（OD260/280≈1.8）。

2. 酶切线性化：

- 体系（50 μL）：pCRISPR质粒 2 μg + 10× NEB CutSmart Buffer 5 μL + BsaI（高保真）5 μL + ddH2O补至50 μL。

- 条件：37℃ 2 h → 65℃ 20 min（灭活酶）。

- 胶回收：切下线性化载体条带，用胶回收试剂盒纯化，回收浓度≥50 ng/μL。

3. 寡核苷酸退火：

- 体系（20 μL）：正向寡核苷酸（100 μM）1 μL + 反向寡核苷酸（100 μM）1 μL + 10× Annealing Buffer 2 μL + ddH2O 16 μL。

- 条件：95℃ 5 min → 缓慢降温至25℃（1℃/min）→ 4℃保存。

- 稀释：退火产物用ddH2O 10倍稀释（备用）。

4. 连接转化：

- 连接体系（20 μL）：线性化pCRISPR 1 μL + 稀释退火寡核苷酸 1 μL + 10× T4连接Buffer 2 μL + T4连接酶 1 μL + ddH2O 15 μL。

- 条件：室温2 h或16℃过夜。

- 转化：取5 μL连接产物转化DH5α感受态细胞（冰浴30 min → 42℃热激90 s → 冰浴2 min → 加900 μL无抗LB，37℃复苏1 h）。

- 筛选：涂布含卡那霉素50 μg/mL的LB平板，37℃培养12-16 h。

5. 阳性鉴定：

- 菌落PCR：用通用引物（如pCRISPR-F：5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTT-3'，pCRISPR-R：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTC-3'）扩增插入片段。

- 测序验证：挑取阳性克隆，送测pCRISPR插入位点，确保sgRNA序列无突变，命名为pCRISPR-sgRNA。

（3）感受态细胞制备（电转化用）

1. 接种目标大肠杆菌菌株（如HME63）至5 mL LB，37℃、250 rpm振荡培养至OD600=0.3-0.5。

2. 转接至50 mL LB，继续培养至OD600=0.5-0.6，冰浴15 min。

3. 4℃、6000 rpm离心5 min，弃上清。

4. 菌体用10%预冷甘油洗涤3次（每次重悬后离心），最终重悬于200-400 μL 10%甘油，分装为50 μL/管，-80℃保存。

（4）共转化与诱导同源重组

1. 共转化：

- 取50 μL电转感受态细胞，加入pCas9（42876）1 μL（50-100 ng）+ pCRISPR-sgRNA 1 μL（50-100 ng），轻轻混匀，转移至0.1 cm电击杯。

- 电转参数：1.8 kV、25 μF、200 Ω（电击时间约4-6 ms）。

- 复苏：立即加900 μL 37℃预热LB，30℃、200 rpm复苏3 h（低温减少Cas9泄漏切割）。

2. 诱导λ Red重组（若用HME63菌株）：

- 取100 μL复苏菌液，加L-阿拉伯糖至终浓度0.3%（w/v），30℃诱导1 h（表达Exo、Beta、Gam，促进同源重组） 。

3. 筛选：

- 取100 μL菌液涂布含氯霉素25 μg/mL + 卡那霉素50 μg/mL的LB平板，30℃培养16-20 h（双抗筛选含两种质粒的菌株）。

（5）供体DNA制备（同源重组模板）

1. 设计供体DNA：包含靶基因上下游各300-500 bp同源臂，中间为抗性基因（如卡那霉素抗性基因kanR，用于筛选敲除株）。

2. 制备方式：通过重叠PCR拼接上下游同源臂与抗性基因，或直接合成线性dsDNA（长度≥600 bp，效率更高） 。

3. 纯化：PCR产物用胶回收试剂盒纯化，浓度≥100 ng/μL，-20℃保存。

（6）. 敲除株筛选与鉴定

1. 供体DNA转化：

- 取50 μL含pCas9/pCRISPR-sgRNA的感受态细胞，加入供体DNA 1 μL（100-200 ng），电转（参数同步骤4.1）。

- 复苏：加900 μL无抗LB，30℃复苏2 h。

2. 敲除株筛选：

- 取100 μL菌液涂布含卡那霉素50 μg/mL的LB平板，30℃培养16-20 h（仅发生同源重组的菌株能存活）。

3. 阳性鉴定：

- 菌落PCR：用靶基因外侧引物（远离同源臂区域）扩增，敲除株扩增条带比野生型小（大小为野生型基因大小减去敲除片段+抗性基因大小）。

- 测序验证：挑取疑似阳性克隆，送测扩增片段，确认敲除序列与设计一致。

（7）. 质粒消除（获得无质粒敲除株）

1. 高温消除pCRISPR-sgRNA：

- 挑取单克隆至5 mL含氯霉素25 μg/mL的LB，42℃、250 rpm振荡培养12-16 h（高温抑制高拷贝pCRISPR复制）。

- 梯度稀释：菌液稀释10^-3、10^-4、10^-5倍，涂布无抗LB平板，37℃培养16-20 h。

2. 抗性筛选：

- 挑取单克隆，分别点种含氯霉素25 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL的LB平板，37℃培养12-16 h。

- 筛选出氯霉素抗性、卡那霉素敏感的克隆（已消除pCRISPR-sgRNA）。

3. 进一步消除pCas9：

- 取上述克隆，42℃振荡培养12-16 h，梯度稀释涂布无抗LB平板。

- 挑取单克隆，点种含氯霉素/卡那霉素平板，筛选出双抗敏感的克隆（已消除两种质粒）。

4. 验证：提取质粒，用PCR检测无Cas9/sgRNA条带，确认质粒完全消除。

三、关键注意事项

1. sgRNA设计：必须保证3'端紧邻NGG PAM，避免脱靶（优先选全基因组唯一的20 bp序列） 。

2. 酶切与连接：BsaI为Type IIs酶，酶切后需胶回收纯化载体，减少自连背景；连接时寡核苷酸需退火完全，避免无效连接 。

3. 温度控制：pCRISPR为高拷贝，42℃高温可快速消除；pCas9为低拷贝，需延长高温培养时间以确保消除 。

4. 供体DNA质量：线性dsDNA比环状质粒重组效率高，同源臂长度建议≥300 bp，越长重组效率越高 。

5. 对照设置：需设置野生型对照（无切割条带）、阳性对照（已知敲除株），确保实验可靠性。

四、预期结果

1. 双抗筛选平板：长出含pCas9/pCRISPR-sgRNA的单克隆。

2. 敲除筛选平板：长出卡那霉素抗性的敲除候选株。

3. 菌落PCR：敲除株条带大小与设计一致，野生型条带为野生型基因大小。

4. 测序验证：敲除序列准确无误，无额外突变。

5. 质粒消除：最终获得无质粒、基因稳定敲除的大肠杆菌菌株。