Super PiggyBac Transposase双质粒共转染+稳筛

PiggyBac 双质粒共转染+稳筛实验操作方案--仅供参考

一、

1. 质粒准备

- PB Dual promoter 目的载体（携带你的外源基因、Puro+GFP）

- Super PiggyBac 转座酶辅助质粒

- 质粒要求：无内毒素质粒提取，A260/A280在1.8~1.9之间，浓度≥500 ng/μL

- 经典质量配比：- 推荐最优比例：PB目的载体 : 转座酶 = 9 : 1

- 难转染细胞可调整为 7:3，绝对不要超过5:5（整合后转座酶残留会导致再次跳跃，破坏基因组）

2. 细胞与试剂

- 靶细胞：转染前24h铺板，汇合度转染时达到 70%~80%

- 无血清无双抗基础培养基、完全培养基

- 转染试剂（Lipofectamine 3000/PEI等）

- 嘌呤霉素（Puromycin）、PBS、胰酶

二、正式共转染步骤（以6孔板为例）

1. 转染当天（Day 0）

每1孔用量参考：- 总质粒总量：2.5 μg- PB目的载体：2.25 μg

- 转座酶质粒：0.25 μg

- 转染试剂：按说明书推荐比例搭配（如Lip3000：质粒=2:1）

2. 转染复合物配制1.：用125 μL无血清培养基稀释质粒+P3000试剂，轻柔混匀

2. 用125 μL无血清培养基稀释转染试剂，轻柔混匀

3.  1:1混合，室温静置15~20 min

4. 均匀滴加至6孔板细胞中，轻柔晃匀

转染6~8 h后，弃旧培养基，更换新鲜预热的完全培养基

三、转染效率验证（Day 2，转染48h后）

- 观察CopGFP绿色荧光，正常情况下荧光阳性率应达到30%~70%

- 荧光越多，说明初始转染成功的细胞基数越好，后续筛选压力效果更佳

四、嘌呤霉素稳定筛选

提前确定嘌呤霉素最低致死浓度

通用参考：大部分肿瘤细胞1~3 μg/mL，干细胞/原代细胞0.5~1 μg/mL

正式加压筛选（Day 2~Day 7）

1. 转染48h后，加入预先摸索好浓度的嘌呤霉素完全培养基

2. 每2天更换一次新鲜的嘌呤霉素筛选培养基

3. 筛选标准：- 筛选3~5天：大量阴性细胞死亡漂浮

- 筛选7天左右：存活细胞团清晰，空白对照组细胞全部死亡

- 此时存活的，就是基因组稳定整合PB片段的阳性细胞池

五、稳定细胞株纯化与保种

1. 筛选7天后，降低嘌呤霉素浓度（减半维持）继续培养，即可得到混合稳定细胞池，可直接开展后续功能实验

2. 单克隆稳定细胞株（高纯株）- 有限稀释法：将细胞极度稀释，接种到96孔板，保证每孔0~1个细胞

六、补充：

细胞类型 推荐优化调整

容易转染的肿瘤细胞 9:1质粒比例，常规筛选7天

难转染/干细胞/原代细胞 7:3质粒比例，使用电转代替脂质体

需要极高表达 筛选后流式分选GFP top 10%高表达群。