pKD46质粒

一质粒简介：

pKD46 是大肠杆菌基因敲除/敲入实验的关键辅助质粒，核心作用是提供 λ Red 重组酶的诱导表达，让线性化的抗性片段能高效整合到大肠杆菌基因组中。

1. 转化宿主菌：将 pKD46 转入目标大肠杆菌（如 MG1655、BW25113），30℃ 条件下培养，用氨苄青霉素筛选含质粒的菌株；
2. 诱导重组酶表达：在制备感受态细胞前，加入 L-阿拉伯糖诱导 araBAD 启动子，表达 Exo/Beta/Gam，让细胞具备高效同源重组能力；
3. 介导线性片段重组：将 pKD3 扩增的抗性片段电转入含 pKD46 的感受态细胞，通过 Red 系统实现线性片段与基因组的同源重组；
4. 后续质粒消除：重组完成后，将菌株在 37℃ 条件下传代培养，利用温度敏感复制子的特性，让 pKD46 质粒自然丢失，避免质粒残留影响后续实验。

 

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