pEcgRNA质粒

一  质粒简介：

1. SmR链霉素抗性筛选标记，用于大肠杆菌转化后，通过抗生素平板成功筛选出阳性成功转人质粒的菌株。
2. ccdB毒性基因，负筛选/反筛标记：- 普通大肠杆菌（无ccdA抗性）会被CcdB蛋白杀死
- 只有成功完成片段插入、破坏ccdB完整读码框的重组质粒，才能存活
- 大幅降低空载质粒背景，大幅提高阳性克隆率，是克隆系统的经典自杀筛选元件
3. J23119(Spel) promoter是组成型强持续表达的原核启动子，用来驱动下游gRNA转录。
4. gRNA scaffold 向导RNA的通用保守骨架序列，是CRISPR/Cas系统的核心功能区：

- 和Cas蛋白结合、引导Cas蛋白靶向目标DNA位点
- 搭配上游启动子，完成功能性gRNA的体内转录

6  大肠杆菌基因编辑（CRISPR工具）
作为gRNA表达载体，插入自定义的靶向spacer序列后，在菌体内持续转录功能性gRNA，配合表达Cas9/Cas12蛋白的辅助质粒，精准靶向、敲除/修饰大肠杆菌的内源基因。
7. 高效率无缝gRNA文库构建
自带ccdB自杀筛选+Golden Gate克隆位点、高通量组装gRNA表达单元，构建靶向不同基因的gRNA敲除/干扰文库。
9. 基因表达调控与功能研究- CRISPRi（基因抑制/敲低）：搭配dCas9（失活Cas9），沉默特定基因表达
- 无痕基因敲除、位点突变、基因组精准编辑
- 原菌内代谢通路改造、基因功能验证

 

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