pTargetF质粒

一：质粒简介

pTargetF 是大肠杆菌CRISPR-Cas9基因编辑双质粒系统的核心组分，

用途：
1. 表达sgRNA，引导Cas9靶向切割
它通过组成型启动子J23119持续表达sgRNA，与另一质粒pCas（提供Cas9蛋白）配合，引导Cas9精准切割大肠杆菌基因组的目标位点，实现基因敲除、点突变或插入。
2. 可携带同源修复模板
部分版本的pTargetF可同时携带同源重组修复模板（Donor DNA），与sgRNA协同作用，在Cas9切割后引导宿主菌通过同源重组完成基因组编辑。
3. 编辑完成后可被pCas清除
pCas质粒会诱导表达靶向pTargetF复制子的sgRNA，从而切割并消除细胞内的pTargetF质粒，方便后续实验操作。
4. 主要用于大肠杆菌单基因/多基因敲除、敲入

二：pTargetF + pCas(#62225)双质粒CRISPR-Cas9 大肠杆菌编辑实验流程：

1：构建目标基因的pTargetF重组质粒让质粒带上能引导Cas9找到目标基因的sgRNA。
1） 设计sgRNA- 在目标基因上设计20 bp的靶向序列，PAM序列为 NGG ，避免脱靶。
上下游引物分别包含酶切位点、同源臂和靶向序列，用于PCR扩增线性化载体。
2）. 线性化pTargetF载体- 用  SpeI  单酶切pTargetF质粒，回收线性化载体片段。
3）. 同源重组连接- 将设计好的sgRNA序列与线性化载体进行同源重组（或Gibson组装），转化大肠杆菌感受态。
挑取单克隆，PCR验证+测序，确认sgRNA序列正确。
4）. 质粒提取- 测序正确的克隆扩大培养，提取重组的pTargetF-sgRNA质粒。
2：制备含pCas质粒的大肠杆菌感受态细胞
 1）. 将pCas质粒转化目标大肠杆菌菌株，涂布在含卡那霉素（Kan，50 μg/mL）的LB平板上，30℃培养过夜。
 2）.挑取单克隆，30℃摇菌培养至OD600≈0.4-0.6，制备电转感受态细胞。注意：全程30℃培养，防止pCas的温度敏感复制子被消除。
3：pTargetF-sgRNA质粒转化（CRISPR编辑）
 1）. 将构建好的pTargetF-sgRNA质粒，电转入含pCas的大肠杆菌感受态中。
2）. 复苏后，涂布在含卡那霉素（Kan）+ 壮观霉素（Spe，50 μg/mL）的LB平板上，30℃培养过夜。- 双抗筛选成功，说明细胞同时携带了pCas和pTargetF。
3）. 挑取单克隆，接种到含双抗的LB液体培养基中，30℃摇菌至OD600≈0.2。
4.） 诱导λ-Red重组系统：加入终浓度10 mM的L-阿拉伯糖，继续培养1小时，诱导重组酶表达，为同源修复做准备。 
4：同源重组修复（敲除/敲入/点突变）
敲除/敲入实验：在诱导后，电转同源修复模板（Donor DNA）（PCR扩增的上下游同源臂+筛选标记/目的片段）。
点突变实验：Donor DNA为含目标突变的短单链/双链DNA片段。
 1）. 电转后30℃复苏2小时，涂布在双抗LB平板上，30℃培养过夜。
2）. 挑取单克隆，用菌落PCR扩增目标基因区域，送测序验证编辑是否成功。
5：消除pTargetF质粒
编辑成功后，需要清除pTargetF质粒，避免后续实验受影响。 
1）. 将验证正确的阳性克隆，接种到含卡那霉素（Kan）+ 0.5 mM IPTG的LB液体培养基中，30℃摇菌培养12-16小时。IPTG会诱导pCas上的pTargetF靶向sgRNA表达，切割并消除细胞内的pTargetF。
2）. 稀释菌液，涂布在含卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜。
3）. 挑取单克隆，分别点种到含卡那霉素和含壮观霉素的LB平板上：- 只能在卡那霉素平板生长、无法在壮观霉素平板生长的克隆，即为成功消除pTargetF的菌株。
 6：消除pCas质粒
 如果后续不需要pCas，可将其从菌株中清除，得到无质粒的纯编辑菌株： 
1.） 将消除了pTargetF的菌株，接种到无抗生素的LB液体培养基中，42℃摇菌培养12-16小时。pCas的复制子是温度敏感型，42℃无法复制，质粒会随细胞分裂丢失。
2.） 稀释菌液，涂布在无抗LB平板上，37℃培养过夜。
3）. 挑取单克隆，分别点种到无抗、卡那霉素的LB平板上：- 只能在无抗平板生长、无法在卡那霉素平板生长的克隆，即为成功消除pCas的纯编辑菌株。

产品图谱及序列 展开 +