pCas9质粒

一：质粒简介

大肠杆菌CRISPR-Cas9基因编辑设计的表达质粒，：
 1. 细菌CRISPR系统重建
与配套的pCRISPR质粒（携带自定义gRNA）配合使用，在大肠杆菌中重建功能性CRISPR-Cas9系统，实现靶向DNA切割。
2. 大肠杆菌基因敲除/修饰
通过Cas9对目标基因位点进行双链DNA断裂，结合宿主菌的同源重组或NHEJ修复，实现大肠杆菌基因组的定向敲除、突变或修饰，是细菌基因功能研究的常用工具。
3. 抗噬菌体/外源DNA防御
可在细菌中表达Cas9与靶向特定序列的gRNA，赋予宿主菌抵抗携带靶序列的噬菌体或质粒入侵的能力，用于菌株的生物防御改造。

二：CRISPR-Cas9实验流程
1：pCas9 质粒转化大肠杆菌
（1）冰上融化感受态细胞，加入 10-100 ng pCas9 质粒，轻弹混匀。
（2）冰浴 30 min → 42℃热激 90 s（电转则1.8 kV脉冲）→ 迅速放回冰上 2 min。
（3）加入无抗LB液体培养基，37℃摇床复苏 1 h。
（4）取菌液涂布 氯霉素抗性平板，37℃过夜培养。
（5）挑取单克隆，PCR验证质粒，得到含pCas9的稳定菌株。 
2：构建含靶标gRNA的pCRISPR质粒 
（1）. 设计靶向目标基因的gRNA（需含NGG PAM序列，避免脱靶位点）。
（2）. 将gRNA序列克隆到pCRISPR质粒的crRNA表达区（常用BsaI/ BsmBI酶切连接）。
（3）. 转化大肠杆菌，用对应抗性筛选，测序验证正确的质粒。 
3：pCRISPR 质粒转化含pCas9的菌株 
（1）. 制备含pCas9菌株的感受态细胞（或直接用新鲜单克隆制备电转感受态）。
（2）. 加入 50-100 ng pCRISPR质粒（如需同源重组，可同时加入修复模板），重复转化流程。
（3）. 涂布 双抗性平板（氯霉素 + 氨苄/卡那霉素），30℃或37℃培养过夜。
 4：阳性克隆验证 
（1） 挑取单克隆，接种双抗LB液体培养基，摇至对数期。
（2） 提取基因组DNA，用跨靶位点的引物做PCR扩增。
（3）. 直接Sanger测序，或酶切验证（若修复模板引入了新的酶切位点），确认编辑成功。

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