NMY51酵母双杂交菌

基因型：

MATahis3Δ200trp1-901leu2-3,112ade2LYS2：：(lexAop)4-HIS3ura3：：(lexAop)8-lacZ ade2：：(lexAop) 8-ADE2 GAL4

基本信息：

培养基：YPDA

菌株类别：酵母菌

培养条件：28℃，有氧，YPDA

质粒转化：电转

保存方式：30%甘油，-20℃

基本应用：酵母双杂交

菌株简介：

DUALmembrane系统是DUALsystems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术，它利用分离的泛素系统（split-ubiquitin）直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用，是目前市面上唯一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用NMY51酵母菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株Transformation marker为： trp1, leu2-3，报告基因为：HIS3, ADE2 和 lacZ，第一步通过营养缺陷型报告基因（HIS3, ADE2）进行选择性生长筛选，进一步通过 LacZ 报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因，受不同启动子的调控，降低假阳性几率。原理：泛素（ubiquitin）分子量很小，由 76aa 残基组成；泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的 N 端，然后被泛素专一性蛋白酶（UBPs）识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分：N 端（Nub），C 端（Cub）。首先，人为地将泛素 Nub 的 3 位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI 突变为 NubG）。这样与 Cub 的亲合力大大降低，避免了 Cub 和 Nub 自我结合或接近的可能性。其次，将Cub 部分与人工合成的 LexA-VP16 转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下 NubG不与Cub 结合，UBPs 也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后，将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成 bait 融合蛋（bait-cub-LexA -VP16）和 prey 融合蛋白（prey-NubG）。如果 bait 和 prey发生相互作用，就会促使 NubG 和 Cub 的相互接近，被 UBPs 识别，导致 LexA-VP16 的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。 此系统可使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志均为LEU；三种Prey质粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志均为TRP。NMY51酵母菌株可用YPDA在28℃有氧的条件下培养，然后使用30%的甘油保藏菌种。