pT3-myr-AKT-HA, pT/Caggs-NRASV12, pCMV(CAT)T7-SB100）构建小鼠肝癌模型的注射量及关键注意事项

一，质粒功能与注射配比

| 质粒名称          | 作用                                                                 | 推荐注射量（成年小鼠） |

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| pT3-myr-AKT-HA   | 表达持续激活的AKT蛋白（致癌信号通路）                           | 5-10 μg                  |

| pT/Caggs-NRASV12 | 表达突变型NRAS癌基因（驱动肝细胞恶性转化）              | 5-10 μg                  |

| pCMV(CAT)T7-SB100 | 表达Sleeping Beauty转座酶（介导质粒基因组整合）       | 1-2 μg（关键限速因子）|

配比原则：  

- SB转座酶: 致癌质粒 = 1:5~1:10（如：SB 1μg + AKT/NRAS各5μg）  

- 总DNA ≤ 25μg/只鼠（过高易引发急性炎症干扰模型）  

- 溶剂：无菌生理盐水或PBS缓冲液，终体积50-100μl（根据注射方式调整）

二、注射方法与操作细节

1. 推荐方式：尾静脉高压注射（Hydrodynamic Injection）

- 适用小鼠：6-8周龄，雄性C57BL/6或免疫缺陷鼠（如NSG）  

- 操作流程：  

  1. 预热小鼠（37℃环境5分钟促进血管扩张）  

  2. 用1ml注射器（27G针头）在5-8秒内快速注入尾静脉  

  3. 注射后按压止血，观察小鼠状态（30分钟内活动/呼吸）  

（2）模型建立时间线与监测

A[注射后2周] --> B[超声监测肝回声变化]

B --> C[4-6周出现微小结节]

C --> D[8-12周形成肉眼可见肿瘤]

D --> E[组织学验证：H&E染色+免疫组化（AFP/GS/CK19）]

（3）生物安全与伦理合规

- 致癌基因操作：需在BSL-2实验室进行，废弃物高压灭菌  

- 动物福利：  

  - 肿瘤直径>1.5cm或体重下降20%需人道终点  

  - 实验方案通过IACUC审查（提供肿瘤监测计划）  

（4）常见失败原因

- 肿瘤不形成：SB转座酶量不足/质粒比例失调/小鼠品系不敏感（推荐用Alb-Cre;Ptenloxp/loxp背景）  

- 急性肝损伤：注射速度过快（>8秒）或DNA总量过高  

- 非特异性炎症：内毒素污染或注射操作污染  

优化建议与替代方案

1. 提高转化效率：  

   - 联合pCMV-SB100与pT3质粒 预混后静置10分钟（促进转座酶-转座子复合物形成）  

   - 注射前48小时对小鼠肝部进行局部放疗（2Gy）促进DNA整合  

2. 验证模型成功标志：  

   - 血清ALT/AST一过性升高（注射后24-48小时）  

   - 第4周肝脏活检PCR检测致癌基因整合  

3. 替代技术：  

   - 使用CRISPR-Cas9载体（如pX330-sgTrp53）联合注射加速癌变