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大肠杆菌Red基因编辑重组技术总结

时间:2020-05-21 15:52    点击量:

一、技术简介
      Red基因重组技术,能使外源同源线性DNA片段快速与基因组DNA相应基因同源重组,主要包括pKD46、pKD3、pCP20三个协助质粒。pKD46质粒由exo、beta、gam三个基因组成,它们分别编码Exo、Beta、Gam三种蛋白质,在一定浓度阿拉伯糖诱导下或诱导表达此三种蛋白。通过外源构建同源线性片段,导入受体菌,在这三种蛋白的协助下与受体菌基因发生同源重组,最终实现基因的突变和缺失。同时pKD46质粒是温度敏感型质粒,42°C条件下其会自动丢失。pKD3为克隆氯霉素抗性基因提供模板,与此同时在此质粒中,Cm两侧有FRT位点,该位点能够被FLP重组酶识别,当重组酶存在时会将此位点之,间的片段进行剪接,从而实现了Cm'去除,因此不仅为实验进行引入抗性标记,方便了重组菌的筛选,更重要的是此抗性标记会在因FRT位点的引入在需要时被酶切剔除。pCP20能够表达FLP重组酶,进而识别重组到基因组上的FRT位点,由此酶切掉两位点之间引入的抗性基因片段片段,最终实现目的基因的缺失。pCP20同为温敏型质粒,培养条件高于42°C时自动丢失。
     与Red同源重组基因敲除相关的3个酶:
1、Exo蛋白:Exo蛋白是一种核酸外切酶,单亚基的分子量为24 kD,Exo蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA分子,另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端,从DNA双链的5’端向3’端降解DNA,使DNA分子形成3’粘性末端。
2、Beta蛋白:Beta蛋白在Red同源重组中起着决定性作用,具有介导互补单链DNA退火的功能,是一种退火蛋白,单亚基的分子量为25.8 kD。在溶液中,Beta蛋白自发地形成环状结构,紧紧地结合在单链DNA的3’突出端,防止DNA被单链核酸酶降解,并介导互补单链DNA的退火。双链DNA退火完成后,Beta蛋白从DNA双链上解离下来。
3、Gam蛋白:Gam蛋白为16kD的多肽分子,可与RecBCD核酸外切酶结合,抑制其对外源DNA的降解作用,防止外源DNA 进入细胞后被宿主降解。
二、实验步骤
1、制备pKD46/宿主菌电转感受态。
2、制备抗性基因打靶片段。
3、电转,筛选阳性克隆。
4、导入PCP20质粒消除抗性,无痕敲除。
三、相关质粒(点击可查看图谱和序列)
pKD46,氨苄抗性,阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKD46-Tet,四环素抗性,阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKD20,氨苄抗性,阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pREDKI,卡那抗性,I-SceI,阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKDsgRNA-ack 阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶,四环素诱导转录sgRNA
pREDCas9:携带针对氨苄基因的gRNA
pKD13,提供卡那霉素抗性重组模板
pKD4,提供卡那霉素抗性重组模板
pKD3,提供氯霉素抗性重组模板
pCP20:FLP重组酶消除抗性

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