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免疫荧光技术(IFC)

时间:2017-12-09 23:40    点击量:

免疫荧光技术(IFC)  

(一),普通免疫荧光(单标)
将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出,从而可对抗原进行细胞定位。

一般实验过程:
1、切片脱蜡:将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ(10min)-二甲苯Ⅱ(10min)-无水乙醇Ⅰ(5min)-无水乙醇  Ⅱ(5min)-95%酒精(3min)-90%酒精(3min)-80%酒精(2min)-70%酒精(2min),然后蒸馏水浸洗2min。
2、 抗原修复:我们采用微波进行抗原修复,将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯(或修复盒)中的不锈钢(或耐高温塑料)切片架上,加适量的修复液(0.01M枸橼酸缓冲液,pH6.0)于烧杯中,液面要浸过切片组织一定高度,微波炉可先用高档加热使液体沸腾,当加热至沸腾时调到中档,此时开始计时,修复时间为10-15min,此过程中勿使组织干片(修复液要足量)。到时间后将烧杯从微波炉中取出,放入冷水中冷却降温,当修复液降至室温后取出玻片,用PBS(PH7.4)冲洗3遍,每次3min(冲洗过程中切勿对着组织冲洗,以免弄破组织)。
3、血清封闭:用吸水纸擦干玻片,免疫组画笔在组织周围画圈,滴加稀释好的正常山羊血清,室温封闭30min,以减少非特异性染色。
4、加一抗:甩去多余液体,不洗,然后滴加稀释好的一抗,如果做阴性对照实验,就在对照组的切片上滴加PBS。加完一抗后于4°C湿盒中孵育过夜。
5、加荧光二抗: PBST冲洗切片3次,每次3min,吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中20-37℃孵育1h,PBST冲洗切片4次,每次3min。
注意:此步骤及后面所有操作步骤都尽量在暗处进行。
6、复染核:滴加DAPI避光孵育5min,对标本进行染核,PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。
7、封片镜检:用吸水纸擦干切片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像。
(二),普通免疫荧光(双标)
1、 切片脱蜡:将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ(10min)-二甲苯Ⅱ(10min)-无水乙醇Ⅰ(5min)-无水乙醇Ⅱ(5min)-95%酒精(3min)-90%酒精(3min)-80%酒精(2min)-70%酒精(2min),然后蒸馏水浸洗2min。
2、 抗原修复:我们采用微波进行抗原修复,将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯(或修复盒)中的不锈钢(或耐高温塑料)切片架上,加适量的修复液(0.01M枸橼酸缓冲液,pH6.0)于烧杯中,要浸过切片组织一定高度,微波炉可先用高档加热使液体沸腾,当加热至沸腾时调到中档,此时开始计时,修复时间为10-15min,此过程中勿使组织干片(修复液要足量)。到时间后将烧杯从微波炉中取出,放入冷水中冷却降温,当修复液降至室温后取出玻片,用PBS(PH7.4)冲洗3遍,每次3min(冲洗过程中切勿对着组织冲洗,以免弄破组织)。
3、 血清封闭:用吸水纸擦干玻片,免疫组画笔在组织周围画圈,滴加稀释好的正常山羊血清,室温封闭30min,以减少非特异性染色。
4、 加一抗:甩去封闭液,不洗,然后滴加稀释好的一抗( ),加完一抗后于4°C湿盒中孵育过夜(15h)。
5、 加荧光二抗: PBST冲洗切片3次,每次3min,吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光(FITC)标记羊抗小鼠IgG,湿盒中20-37℃孵育1h,PBST冲洗切片4次,每次3min。
注意:此步骤及后面所有操作步骤都尽量在暗处进行。
6、 血清封闭:用吸水纸擦干玻片,滴加稀释好的正常山羊血清,室温封闭30min,以减少非特异性染色。
7、 加一抗:甩去封闭液,不洗,然后滴加稀释好的一抗,加完一抗后于4°C湿盒中避光孵育过夜。(注意:第二种一抗的种属与第一种一抗的种属要来源不同才可以,如小鼠和兔)
 
8、加荧光二抗: PBST冲洗切片3次,每次3min,吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中20-37℃孵育1h,PBST冲洗切片4次,每次3min。(注意:若检测第一种抗体选用的是红色荧光,则第二种必须得选择其他颜色的荧光)
9、复染核:滴加 DAPI避光孵育5min,对标本进行染核,PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。
10、用吸水纸擦干切片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像。
详情请咨询相关网站相关人员。www.kelei-biology.com.
 

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